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朊病毒研究进展

发布时间:2009年11月18日  编辑:张昌盛

bet36365线路检测中心 张昌盛

牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy,BSE)俗称疯牛病,是由朊病毒引起的牛的一种进行性、神经性、高度致死性疾病(OIE2000 )。英国疯牛病的流行和1997年诺贝尔生理学和医学奖授予朊病毒的发现者——B S Prusiner,使朊病毒研究受到各方面的重视(王大伟等,1998)。朊病毒是一种新型的蛋白感染因子,能够引起人和动物的可转移性神经退化疾病,还与老年痴呆有关(田波,1985;王学和田波,1997)。近年来研究证明朊病毒蛋白(PrPc)是由哺乳动物正常染色体上基因编码的。其蛋白质的错误折叠,使得PrPc的一些α螺旋变构为β折叠,引起其三维构象的变化而导致致病的PrPScscrapie isoform of PrP)的产生而发病(Aguzzi A,et al.,1997. Prusiner S B,1982,1997, Stahl N,et al.,1993)。本文对朊病毒及牛海绵状脑病的国内外研究进展进行综述。

1  PrP基因及蛋白的结构

1.1  PrP基因的结构

PrusinerBolton等从羊瘙痒病因子感染的仓鼠脑组织内分离到一种蛋白质,能抵抗蛋白酶的消化,称作PrP。此外,它还具有抵抗非变性去污剂、核酸酶以及糖苷酶的特性,分子量大小为2730kD,称为PrP2730。得到纯化的PrP2730后,对其N端氨基酸序列进行了测定,根据所测氨基酸序列,设计出寡核苷酸探针,发现仓鼠和小鼠体内存在编码PrP的基因,进一步研究发现,该基因存在于人和多种动物的染色体中。人PrP基因位于第20号染色体的短臂上,鼠PrP位于第2号染色体。小鼠和羊的PrP基因含有3个外显子,其中的外显子3与仓鼠的外显子2同源。小鼠和仓鼠PrP基因的启动子部位都含有多个鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸丰富的重复序列,不含TATA盒,鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸丰富的重复序列可能是转录因子SP1的结合位点。正常PrPc合成后迅速被降解,PrPc位于正常细胞的表面,但该蛋白质在细胞中的功能,目前尚不清楚。

1.2  PrP蛋白的结构(金奇,2001)

PrPc含有42%α螺旋,仅含有3%β折叠,而PrPSc含有43%β折叠和30%α螺旋。

比较了11种哺乳动物和1种禽类的PrP氨基酸一级结构,推测其含有4α螺旋区域,应用合成肽对ShaPrP4个区域进行研究,发现其中3个合成肽在水中自动形成淀粉样结构,其组成主要为β折叠。第1α螺旋位于PrP氨基酸序列的第109122位,这一多肽命名为H1;第113127位的合成肽也能形成淀粉结构,形成淀粉样结构最强的多肽是位于第113120位的氨基酸序列AGAAAAGA,这一多肽在目前所知的所有物种的PrP都保守,另外两个多肽第179191位(H3)和第202218位(H4)也能形成淀粉样结构,并以β折叠结构为主。

从结构推测与相应结合肽的研究可以看出,PrPH1H3H4具有很强的形成β折叠的能力,同时在一定条件下,也能形成α螺旋。这一现象为进一步了解PrPSc空间结构的转变提供了线索。

2 PrP蛋白空间构型转变相关的其他蛋白质

越来越多的证据表明,PrPc在向PrPSc转变的过程中有另外的蛋白质大分子参与,目前具体的参与分子还未能得到分离和鉴定,暂时将可能存在的两个分子命名为蛋白质XY

2.1蛋白质X

对含有ShaPrP基因的转基因小鼠研究,认为朊病毒的繁殖与PrPScPrPc之间形成复合物有关。直接的将PrPcPrPSc混合在一起能产生新的PrPSc,但所产生的PrPSc不具有感染性,看来还存在另外一个分子催化这一转变。这一分子大家暂时命名为蛋白质X,蛋白质X的性质现在还不能确定。

2.2蛋白质Y

通过具有相同基因背景小鼠的研究结果认为小鼠体内存在另外一个基因,它与PrP基因很近,但与PrP基因是分离的。该基因所编码的蛋白质对朊病毒所引起的神经系统病变起着修饰作用。将这一蛋白质命名为蛋白质Y

3 朊病毒蛋白的分子互作(李学涛等,2002)

    PrPc 结构具有随机不稳定性,能产生少量的部分解析的单体结构PrP*,这种单体既能变为PrPc,又可转变为PrPSc,或和PrPSc形成复合结构,再转化为PrPSc,在正常情况下,PrP*的量极少,对PrPSc的形成无意义。人TSE,库鲁病(Kuru)、传染性病毒痴呆或克亚病(CreutzefeldtJakob disease,CJD)、吉斯特曼-斯召斯列综合症(Gerstmann-Straussler syndrome,GSS)和致死性家族性失眠症(fatal familial insomina,FFI与编码PrP的基因突变有关,这些突变基因产物的随机不稳定性变高,在生物合成的早期就开始表现出PrPSc的一些特点,以后经加工自发的慢慢转变为致病性的PrPSc,而在受朊病毒蛋白侵染的细胞中,PrPc完成合成加工并运转到细胞表面后才发生PrPcPrPSc转换的,外源的PrPSc侵染细胞后作为模板与寄主细胞的PrPc结合,以聚合体的形式激发PrP*转变为PrPSc。这一转变过程需要内源PrPc和外源PrPSc的特定氨基酸的同源性,同时受各种蛋白质折叠因子的影响,如盐酸胍、某些分子伴侣和硫酸多糖等。PrPc首先通过C末端的第3个螺旋定位位点与PrPSc结合,再转变为PrPScPrPcPrPSc的转变以及淀粉纤丝聚体的形成,可能是通过一种自动催化或模板聚合作用机制完成的。在体外无细胞体系中,PrPSc只能引发亚化学剂量的PrPc发生转变。锚定与细胞膜上的朊病毒蛋白能结合一些硫酸粘多糖、葡萄糖聚合体、金属离子、脂类分子、核酸分子、protocadherin-2BCL-2等,它们可能作为PrPcPrPSc的转变因子起作用[8]。另外,John Collinge(2001)研究发现,遗传因素在患TSE的风险上起重要作用,英国可能因食用BSE牛肉而患vCJD的病人的朊病毒基因都发生了变异,80%以上的患者缺少一种人类白血球抗原(human leukocyte antigen,HLA),这种免疫系统蛋白HLA-DQ7能与PrPSc结合从而帮助识别传染源,这似乎表明免疫系统基因具有击退外来PrPSc的作用。

4. 朊病毒感染引起人和动物的主要疾病

    朊病毒中引起动物疾病常见的是羊瘙痒病,以及近年来在英国流行的疯牛病,引起人们的关注,普遍怀疑这些疾病与在英国发现的新型CJD有关。朊病毒除了感染牛、羊两种重要家畜外,还能感染许多动物,如猫、美洲狮、大耳鹿、雪貂、猫豹、捻角羊和大弯角羚等动物。朊病毒引起的人类疾病KuruCJDGSSFFI其中以CJD最常见。

人和动物常见的朊病毒病见表1

朊病毒病(Prusiner,1997

Table 1  Prion disease Prusiner,1997

疾病                                 发病机制

人类朊病毒病

库鲁病                           通过原始仪式的食人肉而感染

医源性CJD                       由朊病毒感染的HGH、硬脑膜移植物等感染

变异性CJD                       由牛朊病毒感染?

家族性CJD                       PrP基因的种系突变

GSS                           PrP基因的种系突变

致死性家族性失眠症               PrP基因的种系突变(D178NM129

散发性CJD                       体细胞突变或PrPc自发转变成PrPSc


动物朊病毒病

瘙痒病(绵羊)                   遗传易感绵羊的感染

牛海绵状脑病(牛)               以朊病毒污染的肉骨混合物(MBM)感染

可传递的水貂脑病(水貂)         以绵羊或牛的朊病毒感染

慢性消蚀性疾病(黑尾鹿、麋)     未知

猫海绵状脑病(猫)               以朊病毒污染的MBM感染

外源有蹄类脑病(大羚、林羚)     以朊病毒污染的MBM感染

5 牛海绵状脑病的发现及影响

1985年一名养牛工人发现其所饲养的牛群中有一头牛行为异常,行走姿势不协调,并伴有烦躁不安,兽医认为这只是普通的脑脓肿或脑肿瘤而未给过多的关注,接着在同一群牛中又连续出现了4个相同病例,这时兽医才开始怀疑当初所做的诊断。病理检查发现这4头牛和另外有相似症状的6头牛的脑组织和脊髓呈海绵状病变,与羊瘙痒病和人CJD有着相似的病理变化,将其命名为牛海绵状脑病(BSE)。

英国的养牛业在饲料中添加羊和牛的内脏,这可能是导致出现疯牛病的主要原因。BSE的流行给英国的养牛业及相关产业造成了巨大的经济损失,同时也引起了全世界的高度关注。世界卫生组织先后于1991199319951996年就海绵状脑病召开专题研讨会,1994年还同国际兽医组织联合召开了会议。上述会议召开的目的在于考察对于包括疯牛病在内的海绵状脑病的现状、估计可能的传播途径,以及探讨造成传播的危险因素。

6 牛海绵状脑病几种免疫学检测方法比较

    一个国家BSE风险程度,发病状况及监测系统的完善程度成为牛及牛产品国际贸易中一个重要参考指标(OIE,2000)。其中监测系统是否有效,关键取决于检测技术的可靠性。由于BSE的病原不含核酸,且由宿主自身编码,正常机体不会对其产生免疫应答,因此常规的抗体检测技术对该病无效;另外,该病的病原也不能进行体外培养,常规微生物分离、鉴定方法同样无法进行。不过,研究发现该异常蛋白与正常蛋白之间在蛋白酶抗性存在着明显差异,前者在通常情况下能抵抗蛋白酶的消化作用。世界各国在朊病毒理论引导下结合其蛋白酶抗性特征建立起一系列检测方法,如免疫组织化学(IHC)、免疫转印(Western-blotting,WB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。农业部动物检疫所曾对三种检测方法进行过比较,见表2。通过试验发现免疫组化、免疫转印法对BSE检测均具有较高的准确性,与标准品真实情况的符合率均为100%ELISA的符合率较差。免疫组化法操作简单、结果容易判断、价格低廉,是较适合我国使用的检测方法。用该方法对我国部分样品进行检测,结果均为阴性(王志亮等,2001)

2  BSE免疫组化、免疫转印、ELISA三种检测方法的综合比较(王志亮等,2001)

Table 2  Comparison of IHCWBELISA

 

检测方法

准确性

复杂性

设备要求

完成时间

价格(美金/样)

免疫组化

一般

一般

收样后5

2

免疫转印

收样后24

15

ELISA

较高

较高

收样后24

15

7 结语

疯牛病对人、动物感染性强、诊断困难、危害极大的特征已引起各国政府高度重视和关注,我国目前虽尚未发现疯牛病的存在,但也已颁布相关法令,严防传入。同时加强了对疯牛病研究,该项目已列入“863”国家攻关计划,在加强对分子生物学、病原学研究的同时,还将对朊粒的检测和消毒、危害处理等进行研究,做到有备无患,提高对疯牛病的认识和预防。

参考文献

金奇. 2001. 医学分子病毒学. 科学出版社.844845

李学涛,王洪海,孟祥兵. 2002. 朊病毒和朊病毒病研究进展. 生命科学研究, 61):7881

田波. 1985. 亚病毒病毒学的一个新分支. 病毒学报,1190196

王大伟,王学,韩生成,田波,饶子和. 1998. 中国牛朊病毒基因的克隆与序列分析. 微生物学报, 386):417421

王学,田波. 1997. 朊病毒氨基酸序列α-螺旋β-折叠.中国病毒学,124):302308.

王志亮,邹艳丽,R.Meyer,谢仲伦,管恩平,宋翠平,徐天刚,郑东霞,杜文金,滕翔雁,肖肖,王树双,A.Zurbringgen,M.Vandevelde. 2001. 牛海绵状脑病几种免疫学检测方法的比较. 中国动物检疫,185):2427

Aguzzi A,Weissmann C. 1997. Prion research: the next frontiers.   Nature, 389:795798

John C. 2001. HLA-DQ7 antigen and resistance to variant CJD. Nature, 414(15):269270

OIE.2000,International Animal Health Code.9yh.France,261238

Prusiner S B.1982. Novel Proteinaceous Infectious Particles Cause Scrapie Science .Science ,216:136144

Prusiner S B .1997. Prion Diseases and the BSE Crisis.Science, 278:245251

Stahl N,Baldwin M A,Teplow D B et al.1993. Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochemistry,32:19912002

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